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Weinrich, … Glen JefferyNicolas Taveau, Aurélie Cubizolle, … Philippe BrabetJie Ran & Jun ZhouNature Communications Band 13, Artikelnummer: 3156 (2022) Diesen Artikel zitierenViele lebenswichtige Prozesse im Auge unterliegen der zirkadianen Regulierung, und eine zirkadiane Dysfunktion hat sich als potenzieller Treiber der Augenalterung herausgestellt.Ernährungseinschränkung ist eine der robustesten lebensverlängernden Therapien und verstärkt den zirkadianen Rhythmus mit zunehmendem Alter.Hier zeigen wir, dass eine Ernährungseinschränkung die Lebensdauer von Drosophila melanogaster verlängert, indem sie zirkadiane homöostatische Prozesse fördert, die das visuelle System vor alters- und lichtbedingten Schäden schützen.Die Veränderung des positiven Transkriptionsfaktors für die molekulare Uhr des Extremitätenkerns, CLOCK oder der CLOCK-Ausgangsgene, beschleunigt die visuelle Seneszenz, induziert eine systemische Immunantwort und verkürzt die Lebensdauer.Fliegen, die einer Ernährungseinschränkung unterliegen, sind vor den lebensdauerverkürzenden Wirkungen der Photorezeptoraktivierung geschützt.Umgekehrt verlängert die Inaktivierung von Photorezeptoren, die durch die Mutation von Rhodopsin oder die Unterbringung von Fliegen in konstanter Dunkelheit erreicht wird, in erster Linie die Lebensdauer von Fliegen, die mit einer nährstoffreichen Ernährung aufgezogen werden.Unsere Ergebnisse etablieren das Auge als ernährungssensitiven Modulator der Lebensspanne und weisen darauf hin, dass das Sehen ein antagonistisch pleiotroper Prozess ist, der zur Alterung des Organismus beiträgt.Zirkadiane Rhythmen sind ~24-Stunden-Oszillationen im Verhalten, in der Zellphysiologie und in der Biochemie, die sich entwickelt haben, um vorhersagbare Veränderungen im Zusammenhang mit dem Sonnentag (z. B. Räuber-Beute-Wechselwirkungen, Nährstoffverfügbarkeit, Phototoxizität usw.)1 zu antizipieren und zu bewältigen.Zirkadiane Rhythmen werden von endogenen Uhren erzeugt, die Zeitsignale (z. B. Licht und Nahrung) erfassen, um rhythmische Oszillationen von Gen-Transkriptionsprogrammen zu steuern und die Zellphysiologie mit täglichen Umweltstressoren zu synchronisieren2.Die molekulare Uhr hält nicht nur die Zeit, sondern reguliert auch die zeitliche Expression nachgeschalteter Gene, die als uhrgesteuerte Gene bekannt sind, um gewebespezifische Rhythmen in der Physiologie zu fördern3.Die molekulare Uhr von Drosophila besteht aus Transkriptions-Translations-Rückkopplungsschleifen, in denen die Transkriptionsfaktoren Clock (CLK) und Cycle (CYC) rhythmisch ihre eigenen Repressoren Period (PER) und Timeless (TIM) aktivieren2.Diese Rückkopplungsschleife existiert nicht nur in zentralen Schrittmacherneuronen, wo sie den Rhythmus der Bewegungsaktivität bestimmt, sondern sie funktioniert auch in peripheren Geweben wie dem Auge4.Das Altern ist mit einer fortschreitenden Abnahme der Sehfunktion und einem Anstieg des Auftretens von Augenerkrankungen verbunden.Photorezeptorzellen von Drosophila dienen als leistungsstarkes Modell sowohl für visuelle Seneszenz als auch für Netzhautdegeneration5,6.Fotorezeptoren von Drosophila und Säugetieren besitzen einen zelleigenen molekularen Uhrmechanismus, der viele physiologische Prozesse zeitlich reguliert, einschließlich Lichtempfindlichkeit, Stoffwechsel, Pigmentproduktion und Anfälligkeit für lichtvermittelte Schäden7.Visuelle Seneszenz wird von einer reduzierten zirkadianen Amplitude der Core-Clock-Genexpression in der Netzhaut begleitet8.Diese Verringerung der zirkadianen Rhythmen der Netzhaut kann ursächlich für die Augenalterung sein, da Mäuse, die Mutationen in ihren Core-Clock-Genen beherbergen, entweder im gesamten Körper oder nur in ihren Photorezeptorzellen, mehrere früh einsetzende Alterungsphänotypen im Auge zeigen.Diese Mäuse bilden vorzeitig grauen Star und haben eine reduzierte Lichtempfindlichkeit und Lebensfähigkeit der Photorezeptorzellen8.Die molekularen Mechanismen, durch die die molekulare Uhr die Augenalterung beeinflusst, sind jedoch noch nicht vollständig verstanden.Ernährungsrestriktion (DR), definiert als Reduzierung bestimmter Nährstoffe oder Gesamtkalorien, ist der robusteste Mechanismus, um Krankheiten zu verzögern und die Lebensdauer zu verlängern9.Die Mechanismen, durch die DR Gesundheit und Lebensdauer fördert, können integral mit der zirkadianen Funktion verbunden sein, da DR die zirkadiane Transkriptionsausgabe der molekularen Uhr verbessert und die zirkadiane Funktion mit zunehmendem Alter erhält10.Umgekehrt unterdrücken nährstoffreiche Diäten (dh übermäßiger Verzehr von Proteinen, Fetten oder Gesamtkalorien) zirkadiane Rhythmen und beschleunigen die Alterung des Organismus11,12.Wie DR die zirkadianen Rhythmen im Auge moduliert und wie diese Rhythmen die DR-vermittelte Verlängerung der Lebensdauer beeinflussen, musste jedoch noch untersucht werden.Hier haben wir versucht, die zirkadianen Prozesse aufzuklären, die bei DR aktiviert werden, indem wir eine unvoreingenommene mRNA-Expressionsanalyse im 24-Stunden-Zeitverlauf in ganzen Fliegen durchgeführt haben.Wir fanden heraus, dass zirkadiane Prozesse im Auge bei Fliegen, die mit DR aufgezogen wurden, stark ausgeprägt sind.Insbesondere verstärkte DR die rhythmische Expression von Genen, die für Proteine ​​kodieren, die an der Lichtadaption beteiligt sind (dh Kalziumhandhabung und Deaktivierung der Rhodopsin-vermittelten Signalübertragung).Aufbauend auf dieser Beobachtung zeigen wir, dass die Mehrheit dieser zirkadianen Phototransduktionsgene transkriptionell durch CLK reguliert wurden.Die Eliminierung der CLK-Funktion, entweder panneuronal oder nur in den Photorezeptoren, beschleunigte den Sehverlust mit dem Alter.Darüber hinaus erhöhte die Störung der Photorezeptor-Homöostase die systemischen Immunantworten und verkürzte die Lebensdauer.Mehrere augenspezifische CLK-Ausgangsgene, deren Expression als Reaktion auf DR hochreguliert wurde, waren auch für DR- erforderlich, um die visuelle Seneszenz zu verlangsamen und die Lebensdauer zu verlängern.Um zu bestimmen, wie DR die zirkadiane Transkriptionsausgabe verändert, führten wir eine Reihe von Microarray-Experimenten über einen Zeitraum von 24 h in Canton-S-Wildtypfliegen (ganze Fliege) durch, die um 12:12 Uhr in Hell-Dunkel (LD) untergebracht und auf beiden aufgezogen wurden eine Diät mit hohem Hefegehalt (5 %; ad libitum, AL) oder eine Diät mit niedrigem Hefegehalt (0,5 %; DR) (ergänzende Abb. 1a), wobei die rhythmische Transkriptexpression mit dem zirkadianen Algorithmus JTK_CYCLE (ergänzende Daten 1) identifiziert wird.Eine vollständige Beschreibung der in dieser Studie verwendeten Fliegenstämme finden Sie in den Zusatzdaten 2. Unter LD-Bedingungen können Transkripte mit 24-Stunden-Oszillationen von der molekularen Kernuhr („circadian“) oder von rhythmischen Lichtsignalen angetrieben werden13.Um die Wirkung von Licht auf die rhythmische Genexpression zu kontrollieren, führten wir auch Zeitverlaufs-Microarrays unter ähnlichen Bedingungen bei Fliegen durch, denen ein endogen erzeugter circadianer Transkriptionsrhythmus fehlt (tim01-Mutanten).Wir argumentierten, dass die in tim01-Fliegen identifizierten oszillierenden Transkripte wahrscheinlich durch Licht angetrieben werden.Daher haben wir uhrgesteuerte Transkripte als solche definiert, die nur in Wildtypfliegen, nicht jedoch in tim01-Mutanten oszillieren (ergänzende Abb. 1a).Wildtyp-Fliegen, die auf DR gehalten wurden, zeigten fast die doppelte Anzahl an circadianen Transkripten im Vergleich zu Fliegen, die auf AL aufgezogen wurden (Abb. 1a, b und ergänzende Abb. 1b), während die circadianen mutierten tim01-Fliegen keinen signifikanten Anstieg der oszillierenden Transkripte zeigten auf DR (Ergänzende Abb. 1c).Diese Daten weisen darauf hin, dass der DR-vermittelte Anstieg der zirkadianen Transkripte funktionierende molekulare Uhren erfordert und unabhängig von Mechanismen ist, die durch rhythmische Lichtreize (dh Maskierung) beeinflusst werden.Die zirkadiane Genexpression in den Wildtyp-Fliegen war auch robuster bei DR vs. AL;DR-spezifische Oszillatoren waren statistisch rhythmischer (niedrigere zirkadiane P-Werte von JTK_CYCLE) und zeigten größere zirkadiane Amplituden als AL-spezifische Oszillatoren in Canton-S, aber nicht in tim01-Mutantenfliegen (ergänzende Abb. 1d, e).Die Ernährung veränderte auch das zirkadiane Transkriptionsprofil des Wildtyps drastisch, da nur 16 % der DR-Oszillatoren auch auf AL oszillierten (ergänzende Abb. 1b).Darüber hinaus wurden die zirkadianen Transkriptome von AL und DR für unterschiedliche Prozesse angereichert (ergänzende Abb. 1f, g und ergänzende Daten 1).a–c Zirkadiane Transkriptom-Heatmaps für Canton-S-Fliegen, die 24-Stunden-Expressionsdiagramme für Transkripte darstellen, die nur auf DR (a, n = 1487 Transkripte), nur auf AL (b, n = 548 Transkripte) oder auf beiden Diäten (c , n = 259 Transkripte).Zirkadiane Transkripte, die hier aufgetragen sind, sind definiert als JTK_CYCLE P ≤ 0,05 (nicht angepasst, nicht rhythmisch [P ≥ 0,05] in tim01-Mutanten) und sind nach Phase aufgetragen.d Geneontologische Anreicherungskategorien, die Transkripten entsprechen, die sowohl bei AL- als auch bei DR-Diäten durchlaufen werden.P-Werte wurden mit hypergeometrischer Verteilung (findGO.pl, HOMER) ohne Anpassung für multiple Hypothesentests berechnet.e Heatmap der Expression des Phototransduktionstranskripts auf AL und DR.Transkripte, die sowohl bei AL- als auch bei DR-Diäten oszillieren, waren stark angereichert mit Genen, die mit der kanonischen Phototransduktions-Signalkaskade (Abb. 1c, d) assoziiert sind, dem Prozess, durch den Drosophila-Photorezeptorzellen, die primären lichtempfindlichen Neuronen, Lichtinformationen umwandeln in ein chemisches Signal14.Kurz gesagt, die lichtvermittelte Umwandlung von Rhodopsin-Proteinen in ihren meta-Rhodopsin-Zustand stimuliert heterotrimere Gq-Proteine, die eine Phospholipase C (NORPA) aktivieren, die sekundäre Botenstoffe produziert und die Öffnung von transienten Rezeptorpotentialkanälen (TRP, TRPL) fördert, wodurch letztendlich Ca2+ ermöglicht wird und Na+, um die Photorezeptorzelle zu depolarisieren15.Obwohl die Phototransduktions-Transkripte bei beiden Diäten zyklisch waren, wurde ihre Expression bei DR rhythmischer (niedrigere P-Werte von JTK_CYCLE und größere zirkadiane Amplituden) und erhöht (~2-fache Zunahme der Expression über alle Zeitpunkte) (Abb. 1e und ergänzende Abb. 1j).Die Phototransduktionskomponenten wurden in den tim01-Mutanten in ähnlicher Weise hochreguliert exprimiert, zeigten jedoch keine 24-Stunden-Rhythmik (ergänzende Abb. 1k), was darauf hinweist, dass ihre oszillatorischen Expressionsmuster von der intrinsischen molekularen Uhr angetrieben werden und nicht primär auf Licht reagieren .Da unsere Zeitverlaufsanalysen in ganzen Fliegen durchgeführt wurden, haben wir öffentlich verfügbare zirkadiane Transkriptome von Wildtypköpfen abgefragt, um die rhythmischen Oszillationen von augenbezogenen Transkripten weiter zu untersuchen16.Die Mehrheit der DR-empfindlichen Phototransduktionsgene wurde auch in Wildtypköpfen robust zyklisiert (Ergänzungstabelle 1).Bei Drosophila und Säugetieren oszilliert die Sehfunktion, um sich an die täglichen Änderungen der Umgebungsbeleuchtung durch die Sonne anzupassen, die tagsüber 106- bis 108-mal heller sein kann als nachts17.Photorezeptoren sind insofern einzigartig, als sie Mechanismen entwickelt haben, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase in Gegenwart von lichtinduzierten Calciumionengradienten verantwortlich sind, die um Größenordnungen größer sind als das, was andere neuronale Populationen erfahren18,19.Zu den Mechanismen der Lichtanpassung innerhalb von Photorezeptoren gehören das schnelle (Millisekunden) Schließen von TRP-Kanälen (erleichtert durch Enzyme, die durch INAD aufgebaut sind), die Internalisierung von Rhodopsin aus der Rhabdomermembran (z. B. ARR1, ARR2) und der Calciumausfluss (z. B. CALX)20,21 .Akrophase-Analysen (Zeitpunkt der maximalen Expression) zeigten, dass circadiane Transkripte, deren Genprodukte für Proteine ​​kodieren, die die Photorezeptoraktivierung (Ca2+-Einstrom) fördern, während der Dunkelphase eine maximale Expression erreichen, während Gene, die für Proteine ​​kodieren, die die Phototransduktionsreaktion beenden (d. h. Deaktivierung von Rhodopsin- vermittelte Signalisierung) Peak in Erwartung der Lichtphase (Ergänzende Abb. 1l).Diese Ergebnisse liefern eine mögliche mechanistische Erklärung für das rhythmische Reaktionsmuster bei der Lichtempfindlichkeit, das bei Drosophila-Fotorezeptoren22 beobachtet wird (siehe Zusatzdiskussion 1 für zusätzliche Interpretationen).Um festzustellen, ob molekulare Uhren die verstärkte Expression von Phototransduktionsgenen auf DR vermitteln, haben wir das Transkriptom von Fliegenköpfen mit panneuronaler Überexpression einer dominant-negativen Form des Core-Clock-Faktors, CLK (Elav-GS-GAL4 > UAS- CLK-Δ1, bezeichnet als nCLK-Δ1) (ergänzende Fig. 2a).Um potenzielle Entwicklungsstörungen im Zusammenhang mit einer veränderten CLK-Funktion zu vermeiden, verwendeten wir den medikamenteninduzierbaren (RU486) GeneSwitch-Treiber, um CLK-∆ in erwachsenen Fliegen zu exprimieren.Gene, die in nCLK-Δ1-Köpfen herunterreguliert wurden, wurden für Lichtreaktionswege angereichert, einschließlich „Reaktion auf Lichtreiz“ und „Deaktivierung der Rhodopsin-Signalübertragung“ (Abb. 2a, b und ergänzende Daten 3).Darüber hinaus waren Gene, die in Wildtyp-Köpfen sowohl zirkadian als auch in nCLK-Δ1 herunterreguliert waren, stark angereichert für homöostatische Prozesse im Zusammenhang mit der Augenfunktion, während herunterregulierte Gene in nCLK-Δ1, die in Wildtyp-Köpfen nicht zirkadian waren, keine solche Anreicherung zeigten (Ergänzende Abb. 2c und ergänzende Daten 4).Zusammen weist dies darauf hin, dass CLK die transkriptionelle Regulation vieler augenbezogener Prozesse in Drosophila steuert.a GO-Anreicherungswerte entsprechend herunterregulierten Lichtreaktionsgenen in Köpfen von RNA-Seq von nCLK-Δ1 (Elav-GS-GAL4 > UAS-CLK-Δ1) im Vergleich zu Kontrollen.P-Werte wurden mit hypergeometrischer Verteilung (findGO.pl, HOMER) ohne Anpassung für multiple Hypothesentests berechnet.b Heatmap der normalisierten RNA-Seq-Expression entsprechend der Geneontologie-Kategorie „Deaktivierung der Rhodopsin-vermittelten Signalübertragung“ (GO:0016059) in nCLK-Δ1 und Kontrollen zu den Zeitgeberzeiten 0 und 12 (Licht an bzw. Licht aus).c Positive Phototaxis-Antworten für nCLK-Δ1-Fliegen.Für jeden Zeitpunkt werden die Ergebnisse als Mittelwerte des Prozentsatzes positiver Phototaxis ± SEM dargestellt (n = 24 biologisch unabhängige Kohorten von 20 Fliegen, die über drei unabhängige Experimente untersucht wurden, N = 480 Fliegen pro Bedingung).P-Werte wurden durch den zweiseitigen Student's t-Test (ungepaart) bestimmt, wobei die Reaktionen zwischen Ernährung und/oder Genotyp zu jedem Zeitpunkt verglichen wurden.d Boxplots der Elektroretinogramm-Amplituden für nCLK-Δ1-Fliegen und Kontrollen an Tag 14 und 21. Die Daten werden als Tukey-Mehrfachvergleich von Mittelwerten dargestellt: Die horizontale Linie innerhalb jedes Kästchens ist der Median, die Unter- und Oberkante des Kästchens sind untere und obere Quartile , und die Whisker sind Minimal- und Maximalwerte.(n = 8 und 12 biologisch unabhängige Fliegen, gemessen an Tag 14 bzw. 21, untersucht über 1 unabhängiges Experiment).P-Werte wurden durch den zweiseitigen Student's t-Test (ungepaart) bestimmt, wobei die Reaktionen zwischen Ernährung und/oder Genotyp zu jedem Zeitpunkt verglichen wurden.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Angesichts der Fähigkeit von DR, die Homöostase in einer Reihe von Geweben zu verbessern23, und seiner Fähigkeit, die zirkadiane Rhythmik von Lichtreaktionsgenen zu verbessern, untersuchten wir, wie Ernährung und CLK die Sehfunktion mit zunehmendem Alter beeinflussen.Wir haben die positive Phototaxis-Reaktion von Wildtyp-Fliegen (Canton-S und Oregon-R), die entweder mit AL- oder DR-Diät aufgezogen wurden, in Längsrichtung quantifiziert (Versuchsaufbau in ergänzender Abb. 3a).Eine vollständige Beschreibung der positiven Phototaxis-Reaktionen und begleitende Statistiken für alle in dieser Studie verwendeten Stämme finden Sie in den ergänzenden Daten 5. Im Vergleich zu AL-gefütterten Fliegen verlangsamte DR den mit dem Alter beobachteten Rückgang der positiven Phototaxis (ergänzende Abb. 3b, c).Wichtig ist, dass dieser Effekt nicht ausschließlich auf ernährungsabhängige Veränderungen der Bewegungsaktivität zurückzuführen ist, da die Kletteraktivität und die Phototaxis mit zunehmendem Alter unterschiedlich schnell abnahmen (ergänzende Abb. 3d).Im Vergleich zu Wildtypfliegen schützt DR minimal clkout (clk-null) Fliegen vor altersbedingten Abnahmen der Phototaxis (ergänzende Abb. 3e).Im Gegensatz zur clkout-Mutantenlinie verstärkte DR die positiven Phototaxis-Antworten bei Fliegen mit Mutationen im Gen, das das blaulichtempfindliche Cryptochrom-Protein codiert (cry01-, cry02- und cryB-Mutanten) (ergänzende Abb. 3g–i).Diese Diskrepanz zwischen ernährungsabhängigen Reaktionen auf Phototaxis in Kern-Molecular-Clock-Mutanten zeigt, dass die Fähigkeit von DR, Phototaxis-Reaktionen zu verbessern, nicht von CRYs Fähigkeit abhängt, die molekulare Uhr zu photoentrainieren24, während die CLK-Funktion erforderlich ist.nCLK-Δ1- und nCLK-Δ2-Fliegen (eine zusätzliche dominant-negative CLK-Mutante, Elav-GS-GAL4 > UAS-CLK-Δ2) zeigten im Vergleich zu Kontrollen einen beschleunigten Rückgang der positiven Phototaxis mit dem Alter (Abb. 2c und ergänzende Abb. 3f). .Da der positive Phototaxis-Assay eine Verhaltensreaktion auf Licht misst, untersuchten wir als nächstes, wie Ernährung und CLK die Photorezeptorfunktion mit zunehmendem Alter direkt beeinflussen, indem wir extrazelluläre elektrophysiologische Aufzeichnungen des Auges (Elektroretinogramme, ERG25) durchführten.Eine vollständige Beschreibung der ERG-Antworten und begleitende Statistiken für die in dieser Studie verwendeten Fliegenstämme finden Sie in Ergänzende Daten 6. Wir beobachteten größere ERG-Amplituden, dh die lichtinduzierte Summierung von Rezeptorpotentialen von den Photorezeptoren26, bei Kontrollfliegen, die mit DR aufgezogen wurden vs AL an Tag 14 (Abb. 2d).Darüber hinaus wurden die DR-vermittelten Verstärkungen der ERG-Amplituden bei nCLK-Δ1-Fliegen mit zunehmendem Alter signifikant reduziert (Abb. 2d).Da der Elav-GS-GAL4-Treiber auf panneuronale Weise exprimiert wird (dh Photorezeptoren und extraokulare Neuronen), wollten wir untersuchen, wie die Manipulation der CLK-Funktion ausschließlich innerhalb von Photorezeptoren die Sehfunktion mit zunehmendem Alter beeinflusst.Zu diesem Zweck kreuzten wir UAS-CLK-Δ1-Mutantenfliegen und Fliegen, die Wildtyp-CLK (UAS-clk, bezeichnet als CLK-OE) überexprimieren, mit einer Photorezeptor-spezifischen GAL4-Treiberlinie unter der zeitlichen Kontrolle des Temperaturempfindlichen GAL80-Protein (Trpl-GAL4; GAL80ts > UAS-CLK-Δ1, bezeichnet als prCLK-Δ1 und Trpl-GAL4; GAL80ts > UAS-CLK, bezeichnet als prCLK-OE).Um eine mögliche Veränderung der normalen CLK-Funktion während der Entwicklung zu vermeiden, wurden prCLK-Δ1- und prCLK-OE-Fliegen bei 18 °C (GAL80 aktiv, GAL4 reprimiert) aufgezogen und dann nach dem Schlüpfen auf 30 °C (GAL80 reprimiert, GAL4 aktiv) gebracht.Im Vergleich zu Kontrollfliegen (Trpl-GAL4/+; GAL80ts/+) zeigten prCLK-Δ1-Fliegen mit zunehmendem Alter eine beschleunigte Abnahme sowohl der positiven Phototaxis als auch der ERG-Amplitude, während prCLK-OE-Fliegen eine langsamere Rate der visuellen Seneszenz zeigten (Abb. 3a , b und ergänzende Abb. 4b).Am 14. Tag zeigten prCLK-OE-Fliegen eine deutliche DR-vermittelte Verbesserung der positiven Phototaxis im Vergleich zu prClk-OE-Fliegen, die auf AL aufgezogen wurden (Abb. 3a).Interessanterweise konnten wir zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede in den diätabhängigen Reaktionen (AL vs. DR) in den ERGs von prCLK-OE-Fliegen beobachten (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass die reduzierten Phototaxis-Reaktionen auf AL-Diäten bei diesen Linien beobachtet wurden wahrscheinlich verursacht durch Verhaltens- und/oder extraokulare Funktionsänderungen mit zunehmendem Alter.Als nächstes visualisierten wir Tangentialschnitte des Auges, um festzustellen, ob die Unterschiede in Phototaxis und ERG, die wir über Ernährung und Genotyp (prCLK-Δ1 und prCLK-OE) beobachteten, mit morphologischen Veränderungen des Ommatidiums und der Photorezeptoren assoziiert waren.Wir konnten an Tag 2 keine größeren morphologischen Veränderungen zwischen den Genotypen beobachten, was darauf hindeutet, dass diese Gruppen eine normale Ommatidienstruktur entwickelten, wobei das Rhabdomere der R1-7-Photorezeptoren ohne offensichtliche Degeneration deutlich sichtbar war (Abb. 3c).In Übereinstimmung mit den positiven Phototaxis- und ERG-Daten beobachteten wir eine massive Degeneration der Photorezeptoren bei den prCLK-Δ1-Fliegen, während die Kontroll- und prCLK-OE-Fliegen eine normale Ommatidienstruktur und Rhabdomeren aufwiesen (Abb. 3c).Zusammen zeigen die Genexpression, Phototaxis, ERG und morphologische Beobachtungen, dass DR auf CLK-abhängige Weise funktioniert, um die Photorezeptoralterung in der Fliege zu verzögern.a Positive Phototaxis-Antworten für prCLK-Δ1-Fliegen (Trpl-GAL4; GAL80ts > UAS-CLK-Δ1), prCLK-OE (Trpl-GAL4; GAL80ts > UAS-Clk) und Kontrollfliegen (Trpl-GAL4; GAL80ts /+ ) bei 30 °C aufgezogen.Für jeden Zeitpunkt werden die Ergebnisse als Mittelwerte von Prozent positiver Phototaxis ±SEM dargestellt (Kontrolle und prCLK-Δ1: n = 24 biologisch unabhängige Kohorten von 20 Fliegen, die über drei unabhängige Experimente untersucht wurden, N = 480 Fliegen pro Bedingung. prCLK-OE: n = 16 biologisch unabhängige Kohorten von 20 Fliegen, die in 2 unabhängigen Experimenten untersucht wurden, N = 320 Fliegen pro Bedingung).P-Werte wurden durch den zweiseitigen Student's t-Test (ungepaart) bestimmt, wobei die Reaktionen zwischen Ernährung und/oder Genotyp zu jedem Zeitpunkt verglichen wurden.b Boxplots der Elektroretinogramm-Amplituden für prCLK-Δ1, prCLK-OE und Kontrollfliegen, die bei 30 °C aufgezogen wurden.Die Probengrößen (n) entsprechend (b) finden Sie im Abschnitt „Statistik und Reproduzierbarkeit“ innerhalb der Methoden.Die Daten werden als Tukey-Mehrfachvergleich von Mittelwerten dargestellt: Die horizontale Linie innerhalb jedes Kästchens ist der Median, das untere und obere Ende des Kästchens sind untere und obere Quartile, und die Schnurrhaare sind Minimal- und Maximalwerte.P-Werte wurden durch den zweiseitigen Student's t-Test (ungepaart) bestimmt, wobei die Reaktionen zwischen Ernährung und/oder Genotyp zu jedem Zeitpunkt verglichen wurden.c Tangentialschnitte durch prCLK-Δ1, prCLK-OE und Kontrollnetzhäute an Tag 2 und Tag 10. R1-7-Photorezeptoren sind innerhalb jeder hexagonal geformten Ommatidien erkennbar.Weiße Balken in den unteren rechten Ecken stellen 10 Mikrometer dar.Die Anzahl biologisch unabhängiger Wiederholungen für jede Gruppe innerhalb dieses Experiments ist im Abschnitt „Statistik und Reproduzierbarkeit“ angegeben.Zusätzliche repräsentative Bilder sind in der Quelldatendatei enthalten.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Altersbedingte Abnahmen der Gewebehomöostase werden von erhöhten Immunantworten und Entzündungen begleitet27,28.Interessanterweise stellten wir fest, dass Gene, die in nCLK-Δ1-Fliegenköpfen hochreguliert wurden, für immunologische und antimikrobielle humorale Reaktionen signifikant angereichert waren (Abb. 4a, b).Bei Drosophila können mit Schäden assoziierte molekulare Muster eine sterile Immunantwort induzieren, die durch die Expression von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) gekennzeichnet ist, ähnlich den Auswirkungen von Infektionen durch Krankheitserreger29.Wir quantifizierten die mRNA-Expression von AMPs in den Körpern von nCLK-Δ1- und nCLK-Δ2-Fliegen, um festzustellen, ob sich neuronale Schadenssignale im ganzen Körper ausbreiten, um systemische Immunantworten anzutreiben;der Drosophila-Fettkörper erzeugt als Reaktion auf intrinsische Schadenssignale hohe AMP-Spiegel29.Die in dieser Studie verwendeten RT-PCR-Primersequenzen sind in den ergänzenden Daten 7 enthalten. Die AMP-Expression (attA, diptB und dro) war bei Kontrollfliegen, die mit DR aufgezogen wurden, im Vergleich zu AL reduziert;die Expression von nCLK-Δ1 und nCLK-Δ2 erhöhte jedoch die AMP-Expression auf DR (Abb. 4c und ergänzende Abb. 5a).Um diese systemische Entzündungsreaktion weiter zu untersuchen, isolierten und quantifizierten wir Hämolymphe aus nCLK-Δ1 und Kontrollfliegen.In Übereinstimmung mit der Transkriptionsaktivierung von AMPs sowohl im Kopf als auch im Körper von nCLK-Δ1-Fliegen fanden wir, dass das am stärksten hochregulierte Protein in der nCLK-Δ1-Hämolymphe das antimikrobielle Peptid AttC ist (ergänzende Abb. 5b).Darüber hinaus beobachteten wir eine Anreicherung von Proteinen, die mit der Translationsaktivierung (z. B. zytoplasmatische Translation und ribosomale Biogenese) innerhalb der hochregulierten Proteine ​​in der nCLK-Δ1-Hämolymphe assoziiert sind, was die Aktivierung von Hämozyten, den Immuneffektorzellen in Drosophila, widerspiegeln könnte (Supplementary Data 8 )30.Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Störung der neuronalen CLK-Funktion die systemischen Immunantworten erhöht.Wie bei allen gewebespezifischen Treibersystemen können wir jedoch die Möglichkeit nicht ausschließen, dass unser ELAV-GS-GAL4-Treiber in einer kleinen Population nicht-neuronaler Zelltypen exprimiert wird, was theoretisch zu den erhöhten systemischen Entzündungsreaktionen beitragen könnte und/oder Lebensdauer beeinflussen.a GO-Anreicherungswerte, die hochregulierten Entzündungsgenen in Köpfen von RNA-Seq von nCLK-Δ1 gegenüber Kontrollen entsprechen.P-Werte wurden mit hypergeometrischer Verteilung (findGO.pl, HOMER) ohne Anpassung für multiple Hypothesentests berechnet.b Heatmap der normalisierten RNA-seq-Expression entsprechend der Gen-Ontologie-Kategorie „Antimikrobielle humorale Reaktionen“ (GO:0019730) in nCLK-Δ1 und Kontrollen.c Relative Expression von AMP-Genen (attA, diptB und dro), berechnet durch RT-qPCR mit aus nCLK-Δ1-Körpern isolierter mRNA.Die Ergebnisse sind als durchschnittliche log2-fache Veränderung der Expression, berechnet nach der ΔΔ-Ct-Methode, normalisiert auf mit DR-Vehikel behandelte Kontrollproben, sowie das Haushaltsgen rp49 ± SEM (n = 3 biologisch unabhängige Kohorten von Fliegen, N = 30) aufgetragen Fliegen pro Kohorte).P-Werte wurden durch den zweiseitigen Student-t-Test (ungepaart) bestimmt, wobei die log2-fachen Änderungen der Expression verglichen wurden.d Relative mRNA-Expression von Immungenen (attaA, diptB und dro), berechnet durch RT-qPCR mit mRNA, die aus Körpern von w1118- und Rhodopsin-Mutantenfliegen isoliert wurde, die in 12:12 h LD gehalten wurden.Die Ergebnisse sind als durchschnittliche log2-fache Veränderung der Expression, berechnet nach der ΔΔ-Ct-Methode, normalisierten w1118-DR-Kontrollproben sowie rp49 ± SEM (n = 3 biologisch unabhängige Kohorten von Fliegen, N = 30 Fliegen pro Kohorte) aufgetragen.P-Werte wurden durch den zweiseitigen Student-t-Test (ungepaart) bestimmt, wobei die log2-fachen Änderungen der Expression verglichen wurden.e Kaplan-Meyer-Überlebensanalyse von nCLK-Δ1-Fliegen (Elav-GS-GAL4 > UAS-CLK-Δ1), die bei 25 °C aufgezogen wurden.Überlebensdaten sind als Durchschnitt von drei unabhängigen Wiederholungen der Lebensspanne aufgetragen.Kontrollfliegen (vehikelbehandelt): AL N = 575, DR N = 526;nCLK-Δ1-Fliegen (mit RU486 behandelt): AL N = 570, DR N = 565. f Kaplan-Meyer-Überlebensanalyse von prCLK-Δ1-Fliegen (Trpl-GAL4; GAL80ts > UAS-CLK-Δ1) und Kontrolle (Trpl-GAL4/ +; GAL80ts/+), Fliegen, die bei 30 °C aufgezogen wurden.Überlebensdaten sind als Durchschnitt von drei unabhängigen Wiederholungen der Lebensspanne aufgetragen.Kontrollfliegen: AL N = 599, DR N = 501;prCLK-Δ1 fliegt: AL N = 513, DR N = 564. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Um festzustellen, ob die Photorezeptordegeneration eine systemische Immunantwort in Drosophila induziert, haben wir die Photorezeptordegeneration erzwungen, indem wir ATPα im Auge abgebaut haben (GMR-GAL4 > UAS-ATPα-RNAi) und die Expression von AMPs im Körper quantifiziert.Das ATPα-Gen codiert die katalytische Alpha-Untereinheit der Na+K+ATPase, die für die Wiederherstellung des Ionengleichgewichts im Auge während Lichtreaktionen verantwortlich ist31,32.Unsere Entscheidung, den ATPα-Knockdown als Modell für die Degeneration von Photorezeptoren zu verwenden, wurde durch frühere Berichte motiviert, die darauf hindeuten, dass seine Expression zirkadian reguliert ist33 und dass sein Knockdown im Auge zu einer abweichenden Ionenhomöostase führt, die eine altersabhängige, lichtunabhängige Degeneration von Photorezeptoren antreibt34.Der okuläre Knockdown von ATPα machte Fliegen sowohl unter AL- als auch unter DR-Bedingungen im Vergleich zu Kontrollen blind (ergänzende Fig. 5c).Der Abbau von ATPα im Auge führte auch zur Expression von AMPs in den Körpern von Fliegen, die entweder mit einer AL- oder einer DR-Diät aufgezogen wurden (ergänzende Abb. 5d).Somit kann DR die Immunantworten im Zusammenhang mit erzwungener Degeneration von Photorezeptoren nicht unterdrücken.Da wir herausfanden, dass die Degeneration von Photorezeptoren systemische Immunantworten induzierte, postulierten wir, dass die Verringerung der Phototransduktion die Entzündung verringern sollte.Um zu beurteilen, wie Stress durch Umgebungsbeleuchtung die Immunantwort beeinflusst, analysierten wir einen zirkadianen Microarray-Datensatz, in dem Genexpressionsänderungen in Wildtyp-Köpfen (y,w) bei Fliegen verglichen wurden, die bei 12 h Licht und 12 h Dunkelheit (12:12 LD) oder konstant aufgezogen wurden Dunkelheit13.Wir fanden heraus, dass Immunantwortgene zu den am stärksten angereicherten Prozessen gehören, die in den Fliegen hochreguliert werden, die in 12:12 LD gegenüber konstanter Dunkelheit untergebracht sind (ergänzende Abb. 5e, f und ergänzende Daten 9).Wir quantifizierten AMPs in den Körpern von Fliegen, die Rhodopsin-Null-Mutationen beherbergen, um zu bewerten, wie die verschiedenen Photorezeptor-Subtypen die systemischen Immunantworten beeinflussen.Die Drosophila ommatidia besteht aus acht Photorezeptoren (R1-8), die verschiedene Rhodopsine mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber unterschiedlichen Lichtwellenlängen exprimieren35.Die R1-6-Photorezeptoren exprimieren das Hauptrhodopsin Rh1, das von ninaE kodiert wird, während der R7-Photorezeptor entweder Rh3 oder Rh4 exprimiert.Der R8-Photorezeptor exprimiert entweder Rh5 oder Rh636.Die Rhodopsin-Null-Mutanten [ninaE1737, rh3238, rh4139 oder rh6G40] zeigten im Vergleich zu w1118-ausgekreuzten Kontrollen eine Verringerung der Immunmarkerexpression in ihren Körpern (Fig. 4d).Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die Unterdrückung der Rhodopsin-vermittelten Signalübertragung ausreicht, um systemische Immunantworten in Drosophila zu unterdrücken, die unter LD-Bedingungen gehalten werden.Angesichts der starken Assoziationen zwischen chronischer Immunaktivierung und beschleunigter Alterung haben wir die Lebensdauer von nCLK-Δ-Fliegen gemessen27.Sowohl nCLK-Δ1- als auch nCLK-Δ2-Fliegen zeigten eine signifikant verkürzte Lebensdauer, mit einem proportional größeren Verlust der mittleren Lebensdauer bei Fliegen, die mit DR aufgezogen wurden, im Vergleich zu AL (Abb. 4e und ergänzende Abb. 6a – c).Ausführliche Informationen zu den in dieser Studie durchgeführten Überlebensanalysen und begleitenden Statistiken finden Sie in den ergänzenden Daten 10. nCLK-Δ-Fliegen haben eine veränderte CLK-Funktion in allen Neuronen;es ist jedoch möglich, dass der bei diesen Linien beobachtete lebensdauerverkürzende Effekt wesentlich durch den Verlust der CLK-Funktion im Auge verursacht wurde;Andere haben gezeigt, dass CLK in Photorezeptoren im Vergleich zu anderen neuronalen Zelltypen in Drosophila stark angereichert (> 5-fach) ist (ergänzende Abb. 6d)5.Darüber hinaus verkürzte die Überexpression von CLK-Δ1 nur innerhalb von Photorezeptoren (prCLK-Δ1) auch die Lebensdauer (Abb. 4f).Diese Ergebnisse argumentieren, dass die neuronale CLK-Funktion für die durch DR vermittelte Verlängerung der vollen Lebensdauer erforderlich ist, und weisen darauf hin, dass die Funktion des Transkriptionsfaktors CLK in den Photorezeptoren für die Aufrechterhaltung der Sehfunktion im Alter sowie für das Überleben des Organismus wesentlich ist.Frühere Berichte haben gezeigt, dass Lichteinwirkung die Lebensdauer verkürzen kann – die Verlängerung der täglichen Photoperiode oder die Unterbringung von Fliegen in blauem Licht verringern beide die Lebensdauer41,42.Da DR die visuelle Seneszenz verzögert und die rhythmische Expression von Genen fördert, die an der Homöostase der Photorezeptoren beteiligt sind (dh Lichtanpassung, Umgang mit Kalzium), untersuchten wir, wie die Ernährung das Überleben im Zusammenhang mit Licht und/oder Phototransduktion beeinflusst.Um die Wechselbeziehung zwischen Ernährung, Licht und Überleben zu testen, haben wir w1118 (weißäugig) entweder in einem 12:12-LD-Zyklus oder in konstanter Dunkelheit untergebracht.Die Unterbringung von Fliegen in konstanter Dunkelheit verlängerte die Lebensdauer von Fliegen, die auf AL aufgezogen wurden, während die Lebensdauer von Fliegen, die auf DR aufgezogen wurden, unbeeinflusst blieb (Abb. 5a).Konstante Dunkelheit konnte die Lebensdauer von rotäugigen (w +) Canton-S-Wildtypfliegen nicht verlängern (ergänzende Abb. 7a), was darauf hindeutet, dass der von w codierte ATP-bindende Kassettentransporter und das rote Pigment in den Zapfenzellen, helfen, sich vor einer Verkürzung der Lebensspanne durch ernährungs- und lichtbedingten Stress zu schützen43.Weißäugige Photorezeptor-Nullfliegen (homozygot für die TRPP365-Mutation44), die auf AL aufgezogen wurden, zeigten keine Verlängerung der Lebensdauer in konstanter Dunkelheit (ergänzende Abb. 7b), was darauf hinweist, dass die lebensdauerverkürzenden Wirkungen der Lichteinwirkung hauptsächlich durch die Photorezeptoren vermittelt werden.a Überlebensanalyse von w1118-Fliegen, die in 12:12 h LD oder konstanter Dunkelheit (DD) gehalten wurden.Überlebensdaten sind als Durchschnitt von drei unabhängigen Wiederholungen der Lebensspanne aufgetragen.b–f Überlebensanalyse von w1118;ninaE17, w1118;rh32, w1118;rh41, w1118;rh6G und w1118;Gqα1-Mutanten im Vergleich zu w1118-Kontrollfliegen, untergebracht in 12:12 h LD.Überlebensdaten sind als Durchschnitt von drei unabhängigen Wiederholungen der Lebensspanne aufgetragen.*Die Überlebenskurven für w1118 sind zum visuellen Vergleich neu gezeichnet (b–f), und die w1118- und Rhodopsin-Null-Lebensdauer-Wiederholungen wurden gleichzeitig durchgeführt.Alle Mutantenlinien wurden mit w1118 ausgekreuzt.g Hazard Ratios für Rhodopsin- und Gq-Mutantenfliegen im Vergleich zu w1118-Kontrollfliegen (Verhältnisse < 1 zeigen Fliegen an, die im Vergleich zu w1118 mit größerer Wahrscheinlichkeit überleben).Die Hazard Ratio für jeden Stamm wird als Maß für die Mitte aufgetragen, und die Fehlerbalken geben das 95 %-Konfidenzintervall der Hazard Ratios an.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Int.